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探討造成PCR進入平坡的原因
日期：2022-11-11 01:31
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摘要：擴增平坡
擴增反應并不是可以無窮地進行下去的，經過一定的循環周期后需擴增的片段不再按指數增多而逐漸進入平坡；進入平坡的循環次數，取決于起始時存在的模板拷貝數以及合成的DNA總量。所謂平坡就是批PCR循環的后期，合成產物達0.3～1pmol時，由于產物的堆積，使原來以指數增加的速率變成平坦的曲線。 造成PCR進入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活，這幾中因素在標準反應中均不會出現。
此外，還有幾種可能：
1．底物過?！ ∫駾NA合成量多于反應液中存在的Taq酶，在100μl反應液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達1μg（3nmol脫氧核苷酸）時，開始變為底物過剩。延長延伸時間或添加Taq酶，可以克服之。但不實用，因每進行下一循環就要延長延伸時間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續保持指數增長。
2．非特異性擴增產物的競爭 與上述情況密切相關，此時不需要的DNA片段與需要的片段同時競爭聚合酶，要克服這一情況是要提高反應特異性，使不需要片段不能大量積聚。
3．退火時產物的單鏈自己締合 兩條單鏈的DNA片段在退火時除了與引物締合外，也可以自行締合，這也會阻止產品增多。當產物濃度到達10pmol/100μl時即可發生此現象，除稀釋外無法克服。
4．變性在高濃度產物條件下，產物解鏈不完全，以及終產物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA）。 總而言之，PCR的條件是隨系統的而異的，并無統一的佳條件，先選用通用的條件擴增，然后稍稍改變各參數，可以達到優化，以取得優良的特異性和產率。